1. INTRODUCCIÓN

El radioinmunoanálisis (RIA) es una técnica analítica basada en la determinación cuantitativa o cualitativa de una sustancia biológica mediante el empleo de técnicas radioquímicas e inmunológicas.

Se puede utilizar para determinar cualquier compuesto capaz de actuar como inmunógeno o hapteno, es decir, capaz de producir anticuerpos.

Su principal ventaja es la combinación de la elevada especificidad de las técnicas inmunológicas con la sensibilidad de los métodos radioquímicos, por lo que podemos determinar concentraciones del orden de los picomoles.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO

Es una técnica analítica competitiva donde un antígeno compite con un antígeno marcado para unirse a su anticuerpo específico, que se encuentra en menor proporción que estos.

Cuando la concentración de antígeno no marcado es baja hay una gran cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo. Sin embargo, cuando la concentración de antígeno es elevada desplaza al antígeno marcado, ya que se establece una competencia entre ambos favoreciéndose la formación del complejo Ag-Ac.

La radiactividad asociada al complejo es inversamente proporcional a la concentración de antígeno no marcado o nativo.

3. ELEMENTOS

3.1 Antígeno nativo o frío

Es el objeto del análisis, es decir, lo que se pretende determinar o cuantificar. También puede utilizarse en la preparación de los estándares para la elaboración de la curva patrón y durante el proceso de preparación del trazador.

3.2. Anticuerpo

El anticuerpo que interviene en la reacción ha de ser específico para el antígeno que queremos cuantificar, sin que exista reactividad cruzada con otros anticuerpos.

Tradicionalmente, los anticuerpos se han obtenido mediante procesos de inmunización animal. Los anticuerpos obtenidos mediante estas técnicas se conocen con el nombre de anticuerpos policlonales.

En la actualidad, la introducción de la técnica de hibridoma ha permitido la obtención de anticuerpos monoclonales, con una afinidad por el antígeno superior a la presentada por los anticuerpos policlonales. En la siguiente tabla se muestra una comparativa de ambos tipos de anticuerpos:

TABLA

3.3 Antígeno marcado o trazador

El trazador es el antígeno marcado con un radionucleido, que presenta un comportamiento inmunológico idéntico al del antígeno que queremos determinar y que puede medirse mediante métodos simples y directos.

El trazador no debe inducir radiolisis y debe emitir una radiación adecuada para su detección con los detectores empleados en técnicas RIA.

Según el tipo de radiación que emitan, los trazadores pueden clasificarse como:

• Emisores B (3н, 14C) -> requieren el empleo de contadores de centelleo líquido. Su preparación es muy laboriosa y el tiempo de recuento es excesivamente largo por lo que su uso en la práctica clínica se encuentra bastante limitado.
• Emisores y (125,57 co, 75se, 59Fe) -> el trazador utilizado más frecuentemente es el 125,. Posee una energía de emisión gamma de 35 keV y una vida media de 60 días lo que permite su utilización durante un periodo prolongado de tiempo. El yodo se incorpora al anillo aromático de la tirosina empleando agentes oxidantes como la cloramina T, hipoclorito o lactoperoxidasa, que reducen el yodo a yoduro.

3.4. Estándares

Se utilizan para la elaboración de la curva patrón, la cual tiene como objetivo expresar resultados consistentes entre diferentes laboratorios y a diferentes tiempos dentro del mismo laboratorio.

4. ETAPAS DE UN RADIOINMUNOANISIS

La primera etapa de un RIA consiste en la preparación de las muestras, que pueden ser plasma, suero y orina.

En ocasiones no es necesario procesar la muestra aunque en otras se requiere un paso previo en el cual se eliminan sustancias que puedan dar lugar a reacciones cruzadas con el anticuerpo de la reacción como la fibrina, lípidos y determinados fármacos.

El segundo paso es la formación del complejo Ag-AC. La cantidad de anticuerpo añadida al análisis es limitada e inferior a la cantidad de antígeno total, por lo que va a quedar saturado con él.

Además del anticuerpo y del antígeno presente en la muestra se añade una cantidad constante y conocida de antígeno caliente o radiactivo. Los dos tipos de antígenos, frío y caliente, van a competir, en igualdad de condiciones, por unirse con el anticuerpo disponible.

Las concentraciones del antígeno marcado y del anticuerpo son constantes, la única variable es la concentración de antígeno no marcado. Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío en la muestra problema, este desplazará al antígeno caliente y por tanto se fijarán al anticuerpo cantidades menores de antígeno marcado.

Tras la reacción se procede a la separación del complejo antígeno-anticuerpo de la fracción libre. Dicha separación se basa en las distintas propiedades fisico-químicas que presentan el complejo Ag-Ac y el Ag libre.

Para la separación se pueden utilizar distintas técnicas como la electroforesis, la filtración en gel o la adsorción con distintos materiales (resinas, carbón etc, etc.) . Actualmente estos métodos están en desuso debido a su laboriosidad y excesiva duración.

Existen otras técnicas más simples y prácticas como la producción de un precipitado y posterior separación del sobrenadante (exceso de Ag) empleando etanol, propilenglicol o el sulfato amónico, que alteran la solubilidad de las proteínas provocando su precipitación.

Cuando el antígeno tiene una masa molecular considerable se emplea la técnica del doble anticuerpo. En esta técnica, una vez se ha formado el complejo Ag-Ac se añade al medio de reacción un segundo anticuerpo en exceso frente al complejo formado. De esta manera conseguimos que aumente el tamaño del complejo, favoreciendo así su precipitación. El inconveniente de esta técnica es que este segundo anticuerpo puede desplazar al primero en su unión con el antígeno, alterando los resultados obtenidos.

En la actualidad, por su sencillez y brevedad se emplean métodos de separación en fase sólida, que consisten en inmovilizar al anticuerpo en un soporte sólido que puede ser la propia pared del tubo, bolitas de vidrio o partículas de Sephadex. La separación se consigue simplemente aspirando el medio de incubación.

Una vez separadas las fases se procede a la lectura de la radiactividad de la fase ligada utilizando un contador gamma (v) si el isótopo utilizado es el 125 (V) o un contador B en el caso del tritio (3н).

Los resultados obtenidos tras el contaje se interpolan en la curva patrón obteniendo de esta forma la concentración de antígeno presente en la muestra.

La representación puede llevarse a cabo utilizando la concentración de antígeno frente las cuentas obtenidas de cada estándar, a la actividad de la fracción libre o al cociente de la actividad de la fracción ligada y la libre.

En la actualidad, la forma más empleada es la representación del porcentaje de B/Bo frente al logaritmo de la concentración de antígeno, siendo B la actividad de cada estándar y Bo la actividad perteneciente al estándar 0, que es el que carece de antígeno y al que se le asigna el valor 100. De esta forma se obtiene la siguiente curva sigmoide:

5. CARACTERÍSTICAS DE UN ENSAYO RIA

A la hora de llevar a cabo un ensayo RIA hay que evaluar los siguientes parámetros:

• Sensibilidad: mínima concentración de analito que puede ser detectada. En el caso de los ensayos RIA se pueden determinar concentraciones del orden de los picomoles.
• Especificidad: capacidad de un método de detectar únicamente la sustancia buscada
• Exactitud: grado de identidad de los valores obtenidos en el ensayo y el contenido real del analito en la
• Precisión: grado de dispersión o agrupamiento de los datos obtenidos para una muestra procesada varias veces. Se distingue:
  • Precisión intraensayo: se obtiene cuando se procesan varias réplicas de diferentes muestras en el mismo ensayo (repetibilidad, CV < 10%)|
  • Precisión interensayo: se obtiene entre determinaciones independientes realizadas bajo diferentes condiciones (reproducibilidad, CV < 20%).

Para llevar a cabo la evaluación de estos parámetros y validar un método RIA se realizan los siguientes ensayos:

• Ensayo de recuperación: evalúa la capacidad del método de recobrar una concentración exógena de analito añadida a una muestra cuya concentración de analito se ha determinado previamente.
• Ensayo de paralelismo: se llevan a cabo diluciones seriadas del antígeno y se elabora una curva que ha de ser paralela a la curva estándar.
• Ensayo de correlación: se compara el método utilizado con una técnica de referencia para determinar la equivalencia de métodos analíticos diferentes.